乙酰葡糖胺修飾（O-GlcNAc）是共價連接到蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸羥基上的一種普遍的糖基化修飾。研究表明，O-GlcNAc修飾在調(diào)控蛋白質(zhì)功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)之間相互作用等。O-GlcNAc糖基化在細(xì)胞內(nèi)僅由一對酶進(jìn)行可逆地調(diào)控，分別是O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶（OGT）和O-GlcNAc水解酶（OGA）。該修飾不僅是細(xì)胞營養(yǎng)狀態(tài)的關(guān)鍵感受器，更參與了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的精細(xì)調(diào)控。然而，由于糖基化修飾具有高度的動態(tài)性和異質(zhì)性，傳統(tǒng)的化學(xué)抑制劑或基因敲除手段往往缺乏足夠的時空分辨率，且難以模擬和調(diào)控生理條件下瞬時的修飾動態(tài)，這極大地限制了對糖基化在特定微環(huán)境中功能的研究。

近日，浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)研究所易文/朱強(qiáng)團(tuán)隊在Cell Chemical Biology雜志在線發(fā)表題為“Optogenetic Control of Plasma Membrane O-GlcNAcylation Regulates WNK1 Condensates and Cellular Signaling”的研究論文。該研究基于植物光敏系統(tǒng)，成功開發(fā)了紅光可控的O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶（OGT）膜轉(zhuǎn)位系統(tǒng)，可在活細(xì)胞和小鼠活體水平實現(xiàn)細(xì)胞膜O-GlcNAc糖基化對胰島素信號通路活性的精準(zhǔn)操控，更進(jìn)一步揭示了質(zhì)膜O-GlcNAc糖基化抑制WNK1-OSR1激酶復(fù)合物相分離，進(jìn)而阻斷細(xì)胞滲透壓應(yīng)答的新機(jī)制。

REDMAP系統(tǒng)是一種基于植物擬南芥光敏蛋白PhyA及其伴侶蛋白FHY1的紅/遠(yuǎn)紅光調(diào)控的光遺傳學(xué)工具。在紅光（660nm）照射下，PhyA與FHY1兩者結(jié)合形成二聚體，在遠(yuǎn)紅光（730nm）照射下解離。研究團(tuán)隊利用這一特性，將PhyA與細(xì)胞膜定位基序CAAX融合表達(dá)，同時將FHY1與OGT融合表達(dá)，構(gòu)建了基于PhyA-FHY1的OGT細(xì)胞膜定位系統(tǒng)。在紅光刺激下，PhyA-CAAX和FHY1-OGT結(jié)合形成復(fù)合體并實現(xiàn)了OGT的細(xì)胞膜招募（圖1A）。研究人員可以像“分子開關(guān)”一樣，瞬間將OGT招募至細(xì)胞膜，誘導(dǎo)局部糖基化。免疫熒光實驗表明只有紅光（660nm）照射能夠誘導(dǎo)OGT的細(xì)胞膜定位。緊接著使用遠(yuǎn)紅光（730 nm）照射則可逆轉(zhuǎn)這一過程（圖1B）。將含有光遺傳系統(tǒng)的元件以腺病毒的方式感染小鼠的肝臟，發(fā)現(xiàn)紅光誘導(dǎo)的OGT膜定位能夠抑制胰島素信號通路的激活，導(dǎo)致小鼠體內(nèi)胰島素抵抗增加（圖1D-1E）。

圖1 紅光可控的OGT膜定位

通過比較光照前后的糖基化以及磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)在紅光誘導(dǎo)的條件下WNK1的糖基化修飾顯著升高，WNK1激酶下游的效應(yīng)蛋白的磷酸化水平也有顯著的改變，表明OGT的膜定位可能參與調(diào)控WNK1信號通路。通過質(zhì)譜結(jié)合點突變實驗證實了T1949為WNK1的主要O-GlcNAc糖基化位點（圖2A-2B）。功能實驗表明，T1949A突變顯著增強(qiáng)了WNK1下游信號傳導(dǎo)。紅光照射誘導(dǎo)的OGT膜定位有效抑制了野生型（WT）細(xì)胞中的WNK1下游信號，但對T1949A突變體細(xì)胞無顯著影響(圖2C)?；罴?xì)胞體積監(jiān)測實驗表明在50 mM山梨醇誘導(dǎo)的高滲應(yīng)激下，表達(dá)T1949A WNK1的細(xì)胞表現(xiàn)出比WT細(xì)胞更快的體積恢復(fù)速率。紅光照射顯著延緩了WT細(xì)胞的體積恢復(fù)，而對T1949A細(xì)胞則無此效應(yīng)(圖2D)。這表明紅光誘導(dǎo)的WNK1 O-GlcNAc糖基化通過抑制WNK1信號通路，進(jìn)而阻滯了細(xì)胞體積的恢復(fù)。研究表明WNK1與OSR1結(jié)合，形成生物分子凝聚體，從而激活下游信號傳導(dǎo)過程。免疫熒光分析顯示，紅光照射顯著抑制了WT細(xì)胞中WNK1相分離聚點的形成，而在T1949A細(xì)胞中未觀察到類似現(xiàn)象(圖2E)。此外，研究人員利用化學(xué)半合成技術(shù)制備的T1949位點特異性O(shè)-GlcNAc修飾多肽進(jìn)行的體外MST實驗，發(fā)現(xiàn)該位點的糖基化修飾顯著削弱了WNK1與OSR1的相互作用 (圖2F)。體外相分離實驗進(jìn)一步證WNK1的糖基化修飾抑制了其與OSR1的相分離 (圖2E)。綜上所述，紅光誘導(dǎo)的OGT膜定位通過介導(dǎo)WNK1 T1949位點的O-GlcNAc糖基化，抑制了WNK1與OSR1的相分離(圖2G)，從而負(fù)向調(diào)控WNK1下游信號通路。

圖2 紅光誘導(dǎo)的OGT膜定位抑制WNK1相分離

總之，該研究開發(fā)了紅光可控的OGT質(zhì)膜定位的化學(xué)工具，還深入揭示了O-GlcNAc修飾通過抑制WNK1-OSR1相分離來調(diào)控細(xì)胞滲透壓感應(yīng)的新機(jī)制（圖3）。該技術(shù)可用于其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位的糖基化水平調(diào)控，為解析亞細(xì)胞水平的糖基化功能提供新的研究工具和策略。

圖3 工作模式圖

浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院百人計劃研究員朱強(qiáng)和博士后劉倩玉為論文的共同第一作者。朱強(qiáng)研究員與易文教授為論文的共同通訊作者。生科院王勇研究員參與了這項工作并指導(dǎo)了相分離模擬等實驗。

轉(zhuǎn)載自浙江大學(xué)求是新聞網(wǎng)